Automation of an Atomic Force Microscope for nanomechanical analysis in cell populations - LAAS - Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes Accéder directement au contenu
Thèse Année : 2020

Automation of an Atomic Force Microscope for nanomechanical analysis in cell populations

Automatización de un Microscopio de Fuerza Atómica para el análisis nanomecánico en poblaciones celulares

Automatisation des mesures AFM pour des applications en biologie

Résumé

In recent years mechanical phenotype of cells (such as adhesion, elasticity, stiffness), also known as mechanical properties, has been proved to be a valid identifier to distinguish healthy cells from diseased cells. Researchers around the world have related the mechanical phenotype to cancer, cardiovascular, and blood-related diseases, among others. Atomic force microscopy (AFM) is the most used technique to measure mechanical properties, and it makes it possible to obtain the properties at the nanoscale. However, AFM manipulation requires high technical skills, and initially, it was not designed for biological samples. However, the capability to analyze samples in air or liquid in recent years makes it more appealing for the living area. However, using the current AFMs, it is not straightforward to analyze a high number of cells or cell populations, and then it is difficult to obtain statistical results. This doctoral thesis aims at solving the problem of low throughput, an automated methodology is proposed to do it. This methodology is based on the combination of two techniques, cell arrays, and AFM automation. The mechanical measurements are done automatically by executing a developed Jython script, and the cells are immobilized in known positions proposing here a number of conducted measurements compared with was found in the literature. Firstly, Immobilization is done for the microbes in microfabricated PDMS stamps and the mammalian cells in commercial cell arrays (BIOSOFT and CYTOO). The immobilization is done, in the case of the microbes, using convective/capillary assembly technique reaching ~85 % filling rate. And for the mammalian cells, the technique used attached the cell to a surface previously functionalized. Next, the AFM was modified to perform the measurements automatically. The automation was made by developing a Jython written script and executed directly in a commercial BioAFM (JPK Germany). The script is versatile, and it has been adapted, or it can be adapted to several sample configurations. The script performs a small number of indentations (9 or 16) on the sample, acquiring force curves from different regions of the cells and at the same time, reducing the time spent on each cell. The results demonstrated that increasing the number of cells impacts the number of measurements done to the cells, and it is still possible to obtain results comparable to the results reported in the literature. For the first time, the stiffness analysis on ~900 yeast cells (C. albicans) is reported, and it is evident the presence of two subpopulations. We compared native yeast cells with caspofungin treated yeast cells. The results were obtained in 4 h with 9 indentations per cell. For the HeLa cells, the comparison was made between native HeLa cells and fixed HeLa cells; and ~80 cells were analyzed in 30 minutes. In both cases (mammalian and yeast cells), a shift between the native and treated cells was observed, this shift agrees with the literature and proves that is possible to reduce the number of indentations done to the cells if the number of analyzed cells is high. Thanks to the massive amount of data collected, it was possible to use Machine learning, and the preliminary results show that it is possible to distinguish between native and treated cells. The differentiation was made entering the descriptors: stiffness, adhesion, and work of adhesion to the machine learning algorithm. This work contributes to achieving a statistical significance, which is one of the main drawbacks of AFM mechanical analysis and can be considered as one of the first steps to have a diagnostic tool from the atomic force microscope.
Ces dernières années, le phénotype mécanique des cellules (tel que l'adhésion, l'élasticité, la rigidité), également connu sous le nom de propriétés mécaniques, s'est avéré être un identifiant valable pour distinguer les cellules saines des cellules malades. Les chercheurs du monde entier ont établi un lien entre le phénotype mécanique et le cancer, les maladies cardiovasculaires et les maladies du sang, entre autres. La microscopie à force atomique (AFM) est la technique la plus utilisée pour mesurer les propriétés mécaniques, et elle permet d'obtenir les propriétés à l'échelle nanométrique. Cependant, la manipulation de l'AFM requiert des compétences techniques élevées et, à l'origine, elle n'a pas été conçue pour les échantillons biologiques. Cependant, la possibilité d'analyser des échantillons dans l'air ou dans un liquide ces dernières années la rend plus attrayante pour le domaine du vivant. Cependant, avec les AFM actuels, il n'est pas simple d'analyser un nombre élevé de cellules ou de populations cellulaires, et il est ensuite difficile d'obtenir des résultats statistiques. Cette thèse de doctorat vise à résoudre le problème du faible débit, une méthodologie automatisée est proposée pour y parvenir. Cette méthodologie est basée sur la combinaison de deux techniques, les réseaux de cellules, et l'automatisation AFM. Les mesures mécaniques sont effectuées automatiquement en exécutant un script Jython développé, et les cellules sont immobilisées dans des positions connues proposant ici un nombre de mesures effectuées par rapport à ce qui a été trouvé dans la littérature. Premièrement, l'immobilisation est effectuée pour les microbes dans des timbres PDMS microfabriqués et les cellules de mammifères dans des réseaux de cellules commerciales (BIOSOFT et CYTOO). L'immobilisation est effectuée, dans le cas des microbes, en utilisant la technique d'assemblage convectif/capillaire atteignant ~85 % de remplissage taux. Et pour les cellules de mammifères, la technique utilisée a permis de fixer la cellule à une surface préalablement fonctionnalisée. Ensuite, l'AFM a été modifié pour effectuer les mesures automatiquement. L'automatisation a été réalisée par le développement d'un script écrit en Jython et exécuté directement dans un BioAFM (JPK Allemagne). Le script est polyvalent et a été adapté, ou il peut être adapté à plusieurs configurations d'échantillons. Le script réalise un petit nombre d'indentations (9 ou 16) sur l'échantillon, en acquérant des courbes de force de différentes régions des cellules et en réduisant en même temps le temps passé sur chaque cellule. Les résultats ont démontré que l'augmentation du nombre de cellules a un impact sur le nombre de mesures effectuées sur les cellules, et il est encore possible d'obtenir des résultats comparables à ceux rapportés dans la littérature. Pour la première fois, l'analyse de la rigidité sur ~900 cellules de levure (C. albicans) est rapportée, et il est évident la présence de deux sous-populations. Nous avons comparé des cellules de levure natives avec des cellules de levure traitées à la caspofongine. Les résultats ont été obtenus en 4 h avec 9 indentations par cellule. Pour les cellules HeLa, la comparaison a été faite entre les cellules HeLa natives et les cellules HeLa fixées ; et ~80 cellules ont été analysées en 30 minutes. Dans les deux cas (cellules de mammifères et de levure), un décalage entre les cellules natives et les cellules traitées a été observé, ce décalage est conforme à la littérature et prouve qu'il est possible de réduire le nombre d'indentations faites sur les cellules si le nombre de cellules analysées est élevé. Grâce à la quantité massive de données collectées, il a été possible d'utiliser l'apprentissage automatique, et les résultats préliminaires montrent qu'il est possible de distinguer les cellules natives des cellules traitées. La différenciation a été faite en entrant les descripteurs : rigidité, adhérence, et travail d'adhésion à l'algorithme d'apprentissage machine. Ce travail contribue à obtenir une signification statistique, ce qui est l'un des principaux inconvénients de l'analyse mécanique AFM et peut être considéré comme l'une des premières étapes pour disposer d'un outil de diagnostic à partir du microscope à force atomique.
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Origine : Fichiers produits par l'(les) auteur(s)
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Dates et versions

tel-02943902 , version 1 (21-09-2020)
tel-02943902 , version 2 (24-11-2020)

Identifiants

  • HAL Id : tel-02943902 , version 1

Citer

Sergio Proa Coronado. Automation of an Atomic Force Microscope for nanomechanical analysis in cell populations. Biomechanics [physics.med-ph]. Université Paul Sabatier - Toulouse 3, 2020. English. ⟨NNT : ⟩. ⟨tel-02943902v1⟩

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