A lab-on-chip for the separation and the qualification of extracellular vesicules
Un laboratoire sur puce pour la séparation et la qualification des vésicules extracellulaires
Résumé
Extracellular vesicles (or EVs) are heterogeneous nano-sized cellular subspecies released by all cells in the body. They circulate freely in biological fluids and are today considered as potential markers and indicators of many diseases. Thus, identifying and characterizing them remains a major challenge that could lead to rapid diagnosis and prognosis of many diseases. However, due to their heterogeneous sizes, no current technique allows for their proper quantification and characterization. Thus, only a combination of technologies could provide important information on these molecules of interest. To this end, this thesis aims at developing a lab on chip that would allow the isolation of EVs from a biological fluid. To achieve this separation, we chose to use hydrodynamic filtration. This principle allows the separation of particles according to a defined size. It is a simple and passive method (no external field), robust and less prone to clogging than standard filtration techniques. Its principle is based on the size exclusion of particles whose diameter is greater than a defined value, called the cut-off radius, monitored by the ratio of flow rates between a main channel and one or more side channels. We have designed and manufactured microfluidic chips allowing the separation of particles at a cut-off radius adapted to the EV application (between 150 and 900 nm). We used an original microfabrication technique based on successive dry film lamination (DF) and photolithography to manufacture the devices. We demonstrated the proof of concept using three fluorescent biofunctionalized nanoparticles (NP140, N480 and NP 920) covering the EV distribution range. Once the validation was done in synthetic media, we injected biological media spiked with nanoparticles into the sorting devices. We were able to quantify and analyze filtered samples using different techniques (Tunable Resistive Pulse Sensing, flow cytometry, direct counting). We have demonstrated that using our device we were able to collect 35 µL of filtered sample within 30 minutes which is highly compatible with the requirements of the subsequent quantification analysis. We compared filtered samples to injected samples and observed identical concentrations for the nanoparticles (NP 140-CAS, NP 480-OVA) smaller than the cut-off radius, indicating a 100% recovery yield. For nanoparticles larger than the cut off radius (NP 920) and cells present in the biological media (red and white blood cells, etc.) we obtained a filtration yield of the order of 96 to 98 %. We thus demonstrate that the use of biological fluid (blood, plasma, PPL), does not affect the separation results in any way. These results proved that this separation method is a good candidate for treatment of natural samples and could serve as a new range of diagnostic and prognostic tests for pathologies.
Les vésicules extracellulaires (ou EVs) sont des sous-espèces cellulaires, de tailles nanométriques et hétérogènes, libérées par toutes les cellules de l'organisme. Elles circulent librement dans les fluides biologiques et sont aujourd'hui considérées comme de potentiels marqueurs et indicateurs de nombreuses maladies. Ainsi, les identifier et les caractériser reste un défi majeur qui pourrait conduire à des diagnostics et pronostics rapides de nombreuses pathologies. Cependant, de par leurs tailles hétérogènes, aucune technique actuelle ne permet de bien les quantifier et les caractériser. Ainsi, seule une combinaison de technologies pourrait permettre de fournir des informations importantes sur ces espèces d'intérêts. Dans ce but, ce travail de thèse a pour objectif de développer un laboratoire sur puce qui permettrait d'isoler les EVs à partir d'un fluide biologique. Le laboratoire sur puce est basé sur un principe de filtration hydrodynamique permettant la séparation des EVs provenant de milieux complexes. Ce principe permet de séparer les particules selon une taille définie. Il s'agit d'une méthode simple et passive (aucun champ extérieur), robuste et moins sujette au risque de colmatage. Son principe est basé sur l'exclusion en taille des particules dont le diamètre est supérieur à une valeur définie, appelée le rayon de coupure, définie par le rapport des débits entre une canalisation principale et une ou plusieurs canalisations latérales. En choisissant judicieusement les dimensions des canalisations, il a été possible de concevoir plusieurs dispositifs permettant la séparation à un rayon de coupure donné. Nous avons conçu et fabriqué, des puces microfluidiques permettant la séparation des particules à un rayon de coupure adapté à l'application des EVs (entre 150 et 900 nm). Nous avons utilisé une technique originale basée sur le laminage successif de films secs (DF) et la photolithographie. Nous avons fait la preuve de concept à l'aide de trois nanoparticules biofonctionnalisées fluorescentes (NP 140-CAS, N 480-OVA et NP 920) couvrant la gamme de distribution des EVs. Une fois la validation faite dans des milieux synthétiques, nous avons décidé de complexifier les mélanges et nous avons injecté des milieux biologiques associés à de nanoparticules dans les dispositifs de tri. Une fois les différentes séparations effectuées, nous avons pu quantifier et analyser à l'aide de différentes techniques (par Tunable Resistive Pulse Sensing, par cytométrie de flux, par comptage directe) nos échantillons. Nous avons démontré qu'à l'aide de nos dispositifs, nous pouvons récolter 35 µL d'échantillon filtré en 30 minutes d'injection ce qui est hautement compatible avec les exigences de l'analyse de quantification. Nous avons comparé chaque échantillon filtré avec ceux injectés et nous avons observé des concentrations identiques pour les nanoparticules de taille inférieure (NP 140-CAS, NP 480-OVA) au rayon de coupure, nous indiquant un rendement de 100 % de récupération. Pour les autres nanoparticules (NP 920) et les grosses cellules présentes dans les milieux biologiques (globules rouges, blancs, etc...) nous avons obtenu un rendement de filtration de l'ordre de 96 à 98%. Nous démontrons ainsi que l'utilisation de fluide biologique (sang, plasma, PPL), n'affecte en aucun cas les résultats de séparation. Ceci prouve que cette méthode de séparation est un bon candidat pour le traitement des échantillons naturels et pourrait être la base d'une nouvelle génération de tests diagnostiques.
Origine : Version validée par le jury (STAR)